Tube enroulé en acier inoxydable 321 8*1.2 pour échangeur de chaleur

Tubes capillaires

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Un spectromètre à neuf couleurs ultra-compact (54 × 58 × 8,5 mm) et à grande ouverture (1 × 7 mm) a été développé, « divisé en deux » par un réseau de dix miroirs dichroïques, qui a été utilisé pour l'imagerie spectrale instantanée.Le flux lumineux incident avec une section transversale inférieure à la taille de l'ouverture est divisé en une bande continue de 20 nm de large et neuf flux colorés avec des longueurs d'onde centrales de 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 et 690 nm.Les images de neuf flux de couleurs sont mesurées simultanément et efficacement par le capteur d'image.Contrairement aux réseaux de miroirs dichroïques classiques, le réseau de miroirs dichroïques développé présente une configuration unique en deux parties, qui non seulement augmente le nombre de couleurs pouvant être mesurées simultanément, mais améliore également la résolution d'image pour chaque flux de couleur.Le spectromètre à neuf couleurs développé est utilisé pour l'électrophorèse à quatre capillaires.Analyse quantitative simultanée de huit colorants migrant simultanément dans chaque capillaire en utilisant une fluorescence induite par laser à neuf couleurs.Étant donné que le spectromètre à neuf couleurs est non seulement ultra-petit et peu coûteux, mais qu'il possède également un flux lumineux élevé et une résolution spectrale suffisante pour la plupart des applications d'imagerie spectrale, il peut être largement utilisé dans divers domaines.
L'imagerie hyperspectrale et multispectrale est devenue une partie importante de l'astronomie2, de la télédétection pour l'observation de la Terre3,4, du contrôle de la qualité des aliments et de l'eau5,6, de la conservation des œuvres d'art et de l'archéologie7, de la médecine légale8, de la chirurgie9, de l'analyse et du diagnostic biomédicaux10,11, etc. Domaine 1 Une technologie indispensable ,12,13.Les méthodes de mesure du spectre de lumière émise par chaque point d'émission dans le champ de vision sont divisées en (1) balayage ponctuel (« balai »)14,15, (2) balayage linéaire (« panicule »)16,17,18. , (3) la longueur scanne les ondes19,20,21 et (4) les images22,23,24,25.Dans le cas de toutes ces méthodes, la résolution spatiale, la résolution spectrale et la résolution temporelle présentent une relation de compromis9,10,12,26.De plus, le rendement lumineux a un impact significatif sur la sensibilité, c'est-à-dire le rapport signal/bruit en imagerie spectrale26.Le flux lumineux, c'est-à-dire l'efficacité d'utilisation de la lumière, est directement proportionnel au rapport entre la quantité de lumière réelle mesurée de chaque point lumineux par unité de temps et la quantité totale de lumière de la plage de longueurs d'onde mesurée.La catégorie (4) est une méthode appropriée lorsque l'intensité ou le spectre de la lumière émise par chaque point émetteur change avec le temps ou lorsque la position de chaque point émetteur change avec le temps car le spectre de la lumière émise par tous les points émetteurs est mesuré simultanément.24.
La plupart des méthodes ci-dessus sont combinées avec des spectromètres de grande taille, complexes et/ou coûteux utilisant 18 réseaux ou 14, 16, 22, 23 prismes pour les classes (1), (2) et (4) ou 20, 21 disques filtrants, filtres à liquide .Filtres cristallins accordables (LCTF)25 ou filtres acousto-optiques accordables (AOTF)19 de catégorie (3).En revanche, les spectromètres multi-miroirs de catégorie (4) sont petits et peu coûteux en raison de leur configuration simple27,28,29,30.De plus, ils ont un flux lumineux élevé car la lumière partagée par chaque miroir dichroïque (c'est-à-dire la lumière transmise et réfléchie de la lumière incidente sur chaque miroir dichroïque) est pleinement et continuellement utilisée.Cependant, le nombre de bandes de longueurs d'onde (c'est-à-dire de couleurs) qui doivent être mesurées simultanément est limité à environ quatre.
L'imagerie spectrale basée sur la détection par fluorescence est couramment utilisée pour l'analyse multiplex dans la détection et le diagnostic biomédicaux 10, 13.En multiplexage, puisque plusieurs analytes (par exemple, ADN ou protéines spécifiques) sont marqués avec différents colorants fluorescents, chaque analyte présent à chaque point d'émission dans le champ de vision est quantifié à l'aide d'une analyse multicomposante.32 décompose le spectre de fluorescence détecté émis par chaque point d'émission.Au cours de ce processus, différents colorants, chacun émettant une fluorescence différente, peuvent se colocaliser, c'est-à-dire coexister dans l'espace et dans le temps.Actuellement, le nombre maximum de colorants pouvant être excités par un seul faisceau laser est de huit33.Cette limite supérieure n'est pas déterminée par la résolution spectrale (c'est-à-dire le nombre de couleurs), mais par la largeur du spectre de fluorescence (≥50 nm) et la quantité de colorant Stokes Shift (≤200 nm) au FRET (en utilisant FRET)10 .Cependant, le nombre de couleurs doit être supérieur ou égal au nombre de colorants pour éliminer le chevauchement spectral des colorants mélangés31,32.Par conséquent, il est nécessaire d’augmenter le nombre de couleurs mesurées simultanément à huit ou plus.
Récemment, un spectromètre heptachroïque ultra-compact (utilisant un réseau de miroirs heptychroïques et un capteur d'image pour mesurer quatre flux fluorescents) a été développé.Le spectromètre est deux à trois ordres de grandeur plus petit que les spectromètres conventionnels utilisant des réseaux ou des prismes34,35.Cependant, il est difficile de placer plus de sept miroirs dichroïques dans un spectromètre et de mesurer simultanément plus de sept couleurs36,37.Avec une augmentation du nombre de miroirs dichroïques, la différence maximale des longueurs des trajets optiques des flux lumineux dichroïques augmente et il devient difficile d'afficher tous les flux lumineux sur un seul plan sensoriel.La longueur du trajet optique le plus long du flux lumineux augmente également, de sorte que la largeur de l'ouverture du spectromètre (c'est-à-dire la largeur maximale de la lumière analysée par le spectromètre) diminue.
En réponse aux problèmes ci-dessus, un spectromètre ultra-compact à neuf couleurs doté d'un réseau de miroirs décachromatiques « dichroïques » à deux couches et d'un capteur d'image pour l'imagerie spectrale instantanée [catégorie (4)] a été développé.Comparé aux spectromètres précédents, le spectromètre développé présente une différence plus petite dans la longueur maximale du trajet optique et une longueur maximale du trajet optique plus petite.Elle a été appliquée à l'électrophorèse à quatre capillaires pour détecter la fluorescence de neuf couleurs induite par laser et quantifier la migration simultanée de huit colorants dans chaque capillaire.Étant donné que le spectromètre développé est non seulement ultra-petit et peu coûteux, mais qu’il possède également un flux lumineux élevé et une résolution spectrale suffisante pour la plupart des applications d’imagerie spectrale, il peut être largement utilisé dans divers domaines.
Le spectromètre traditionnel à neuf couleurs est illustré à la fig.1a.Sa conception suit celle du précédent spectromètre ultra-petit à sept couleurs 31. Il se compose de neuf miroirs dichroïques disposés horizontalement selon un angle de 45° vers la droite, et le capteur d'image (S) est situé au-dessus des neuf miroirs dichroïques.La lumière entrant par le bas (C0) est divisée par un réseau de neuf miroirs dichroïques en neuf flux lumineux montant (C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 et C9).Les neuf flux de couleurs sont transmis directement au capteur d'image et sont détectés simultanément.Dans cette étude, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 et C9 sont classés par ordre de longueur d'onde et sont représentés par magenta, violet, bleu, cyan, vert, jaune, orange, rouge-orange et rouge, respectivement.Bien que ces désignations de couleurs soient utilisées dans ce document, comme le montre la figure 3, elles diffèrent des couleurs réelles vues par l'œil humain.
Diagrammes schématiques de spectromètres à neuf couleurs conventionnels et nouveaux.(a) Spectromètre conventionnel à neuf couleurs avec un réseau de neuf miroirs dichroïques.(b) Nouveau spectromètre à neuf couleurs avec un réseau de miroirs dichroïques à deux couches.Le flux lumineux incident C0 est divisé en neuf flux lumineux colorés C1-C9 et détecté par le capteur d'image S.
Le nouveau spectromètre à neuf couleurs développé est doté d'un réseau de miroirs dichroïques à deux couches et d'un capteur d'image, comme le montre la figure 1b.Au niveau inférieur, cinq miroirs dichroïques sont inclinés de 45° vers la droite, alignés à droite du centre du réseau de décamères.Au niveau supérieur, cinq miroirs dichroïques supplémentaires sont inclinés de 45° vers la gauche et situés du centre vers la gauche.Le miroir dichroïque le plus à gauche de la couche inférieure et le miroir dichroïque le plus à droite de la couche supérieure se chevauchent.Le flux lumineux incident (C0) est divisé par le bas en quatre flux chromatiques sortants (C1-C4) par cinq miroirs dichroïques à droite et cinq flux chromatiques sortants (C5-C4) par cinq miroirs dichroïques à gauche C9).Comme les spectromètres à neuf couleurs classiques, les neuf flux de couleurs sont directement injectés dans le capteur d'image (S) et détectés simultanément.En comparant les figures 1a et 1b, on peut voir que dans le cas du nouveau spectromètre à neuf couleurs, la différence maximale et la longueur du trajet optique la plus longue des neuf flux de couleurs sont réduites de moitié.
La construction détaillée d'un réseau de miroirs dichroïques ultra-petits à deux couches de 29 mm (largeur) × 31 mm (profondeur) × 6 mm (hauteur) est illustrée à la figure 2. Le réseau de miroirs dichroïques décimaux se compose de cinq miroirs dichroïques sur la droite. (M1-M5) et cinq miroirs dichroïques à gauche (M6-M9 et un autre M5), chaque miroir dichroïque est fixé dans le support supérieur en aluminium.Tous les miroirs dichroïques sont décalés pour compenser le déplacement parallèle dû à la réfraction du flux traversant les miroirs.En dessous de M1, un filtre passe-bande (BP) est fixé.Les dimensions M1 et BP sont de 10 mm (côté long) x 1,9 mm (côté court) x 0,5 mm (épaisseur).Les dimensions des miroirs dichroïques restants sont de 15 mm × 1,9 mm × 0,5 mm.Le pas de matrice entre M1 et M2 est de 1,7 mm, tandis que le pas de matrice des autres miroirs dichroïques est de 1,6 mm.Sur la fig.La figure 2c combine le flux lumineux incident C0 et neuf flux lumineux colorés C1-C9, séparés par une matrice de miroirs déchambres.
Construction d'une matrice de miroir dichroïque à deux couches.(a) Une vue en perspective et (b) une vue en coupe d'un réseau de miroirs dichroïques à deux couches (dimensions 29 mm x 31 mm x 6 mm).Il se compose de cinq miroirs dichroïques (M1-M5) situés dans la couche inférieure, de cinq miroirs dichroïques (M6-M9 et un autre M5) situés dans la couche supérieure et d'un filtre passe-bande (BP) situé en dessous de M1.(c) Vue en coupe dans le sens vertical, avec chevauchement C0 et C1-C9.
La largeur de l'ouverture dans la direction horizontale, indiquée par la largeur C0 sur la figure 2, c, est de 1 mm, et dans la direction perpendiculaire au plan de la figure 2, c, donnée par la conception du support en aluminium, – 7 mm.Autrement dit, le nouveau spectromètre à neuf couleurs a une grande ouverture de 1 mm × 7 mm.Le chemin optique de C4 est le plus long parmi C1-C9, et le chemin optique de C4 à l'intérieur du réseau de miroirs dichroïques, en raison de la taille ultra-petite ci-dessus (29 mm × 31 mm × 6 mm), est de 12 mm.Dans le même temps, la longueur du chemin optique de C5 est la plus courte parmi C1-C9 et la longueur du chemin optique de C5 est de 5,7 mm.Par conséquent, la différence maximale de longueur du trajet optique est de 6,3 mm.Les longueurs de chemin optique ci-dessus sont corrigées pour la longueur de chemin optique pour la transmission optique de M1-M9 et BP (à partir du quartz).
Les propriétés spectrales de М1−М9 et VR sont calculées de telle sorte que les flux С1, С2, С3, С4, С5, С6, С7, С8 et С9 soient dans la plage de longueurs d'onde 520-540, 540-560, 560-580, 580. –600, 600-620, 620-640, 640-660, 660-680 et 680-700 nm, respectivement.
Une photographie de la matrice fabriquée de miroirs décachromatiques est présentée sur la figure 3a.M1-M9 et BP sont collés respectivement sur la pente de 45° et le plan horizontal du support en aluminium, tandis que M1 et BP sont cachés au dos de la figurine.
Réalisation d'une gamme de miroirs décan et sa démonstration.(a) Un ensemble de miroirs décachromatiques fabriqués.(b) Une image divisée en neuf couleurs de 1 mm × 7 mm projetée sur une feuille de papier placée devant un réseau de miroirs décachromatiques et rétroéclairée par une lumière blanche.(c) Un ensemble de miroirs décochromatiques éclairés par une lumière blanche par derrière.(d) Flux de division de neuf couleurs émanant du réseau de miroirs décanes, observé en plaçant une cartouche acrylique remplie de fumée devant le réseau de miroirs décanes en c et en assombrissant la pièce.
Les spectres de transmission mesurés de M1-M9 C0 à un angle d'incidence de 45° et le spectre de transmission mesuré de BP C0 à un angle d'incidence de 0° sont représentés sur les Fig.4a.Les spectres de transmission de C1 à C9 par rapport à C0 sont représentés sur les figures.4b.Ces spectres ont été calculés à partir des spectres des Fig.4a conformément au chemin optique C1-C9 de la figure 4a.1b et 2c.Par exemple, TS(C4) = TS (BP) × [1 − TS (M1)] × TS (M2) × TS (M3) × TS (M4) × [1 − TS (M5)], TS(C9 ) = TS (BP) × TS (M1) × [1 − TS (M6)] × TS (M7) × TS (M8) × TS (M9) × [1 − TS (M5)], où TS(X) et [ 1 − TS(X)] sont respectivement les spectres de transmission et de réflexion de X.Comme le montre la figure 4b, les largeurs de bande (bande passante ≥ 50 %) de C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 et C9 sont 521-540, 541-562, 563-580, 581-602, 603. -623, 624-641, 642-657, 659-680 et 682-699 nm.Ces résultats sont cohérents avec les gammes développées.De plus, l'efficacité d'utilisation de la lumière C0 est élevée, c'est-à-dire que la transmission lumineuse maximale moyenne C1-C9 est de 92 %.
Spectres de transmission d'un miroir dichroïque et d'un flux divisé à neuf couleurs.( a ) Spectres de transmission mesurés de M1-M9 à une incidence de 45 ° et de BP à une incidence de 0 °.(b) Spectres de transmission de C1 à C9 par rapport à C0 calculés à partir de (a).
Sur la fig.3c, le réseau de miroirs dichroïques est situé verticalement, de sorte que son côté droit sur la figure 3a soit le côté supérieur et que le faisceau blanc de la LED collimatée (C0) soit rétroéclairé.Le réseau de miroirs décachromatiques illustré à la figure 3a est monté dans un adaptateur de 54 mm (hauteur) × 58 mm (profondeur) × 8,5 mm (épaisseur).Sur la fig.3d, en plus de l'état représenté sur la fig.3c, un réservoir en acrylique rempli de fumée a été placé devant un ensemble de miroirs décochromatiques, les lumières de la pièce étant éteintes.En conséquence, neuf flux dichroïques sont visibles dans le réservoir, émanant d’un ensemble de miroirs décachromatiques.Chaque flux divisé a une section transversale rectangulaire de dimensions 1 × 7 mm, ce qui correspond à la taille de l'ouverture du nouveau spectromètre à neuf couleurs.Sur la figure 3b, une feuille de papier est placée devant le réseau de miroirs dichroïques de la figure 3c, et une image de 1 x 7 mm de neuf flux dichroïques projetée sur le papier est observée dans la direction du mouvement du papier.ruisseaux.Les neuf flux de séparation des couleurs de la fig.3b et d sont C4, C3, C2, C1, C5, C6, C7, C8 et C9 de haut en bas, ce qui est également visible sur les figures 1 et 2. 1b et 2c.Ils sont observés dans des couleurs correspondant à leurs longueurs d'onde.En raison de la faible intensité de lumière blanche de la LED (voir Fig. S3 supplémentaire) et de la sensibilité de la caméra couleur utilisée pour capturer C9 (682-699 nm) sur la Fig. Les autres flux de division sont faibles.De même, C9 était faiblement visible à l’œil nu.Pendant ce temps, C2 (le deuxième flux en partant du haut) semble vert sur la figure 3, mais semble plus jaune à l'œil nu.
La transition de la figure 3c à d est illustrée dans la vidéo supplémentaire 1. Immédiatement après que la lumière blanche de la LED traverse le réseau de miroirs décachromatiques, elle se divise simultanément en neuf flux de couleurs.Finalement, la fumée dans la cuve s'est progressivement dissipée de haut en bas, de sorte que les neuf poudres colorées ont également disparu de haut en bas.En revanche, dans la vidéo supplémentaire 2, lorsque la longueur d'onde du flux lumineux incident sur le réseau de miroirs décachromatiques est passée de longue à courte de l'ordre de 690, 671, 650, 632, 610, 589, 568, 550 et 532 nm. ., Seuls les flux divisés correspondants des neuf flux divisés dans l'ordre C9, C8, C7, C6, C5, C4, C3, C2 et C1 sont affichés.Le réservoir acrylique est remplacé par un bassin de quartz et les flocons de chaque flux shunté peuvent être clairement observés depuis la pente ascendante.De plus, la sous-vidéo 3 est montée de telle sorte que la partie de changement de longueur d'onde de la sous-vidéo 2 est relue.C’est l’expression la plus éloquente des caractéristiques d’un ensemble de miroirs décochromatiques.
Les résultats ci-dessus montrent que le réseau de miroirs décachromatiques fabriqué ou le nouveau spectromètre à neuf couleurs fonctionne comme prévu.Le nouveau spectromètre à neuf couleurs est formé en montant un ensemble de miroirs décachromatiques avec des adaptateurs directement sur la carte du capteur d'image.
Flux lumineux avec une gamme de longueurs d'onde de 400 à 750 nm, émis par quatre points de rayonnement φ50 μm, situés à intervalles de 1 mm dans la direction perpendiculaire au plan de la figure 2c, respectivement Recherches 31, 34. Le réseau de quatre lentilles se compose de quatre lentilles φ1 mm avec une distance focale de 1,4 mm et un pas de 1 mm.Quatre flux collimatés (quatre C0) sont incidents sur le DP d'un nouveau spectromètre à neuf couleurs, espacés de 1 mm d'intervalle.Un réseau de miroirs dichroïques divise chaque flux (C0) en neuf flux de couleurs (C1-C9).Les 36 flux résultants (quatre ensembles de C1-C9) sont ensuite injectés directement dans un capteur d'image CMOS (S) directement connecté à un réseau de miroirs dichroïques.En conséquence, comme le montre la figure 5a, en raison de la faible différence de chemin optique maximal et du chemin optique maximal court, les images des 36 flux ont été détectées simultanément et clairement avec la même taille.Selon les spectres en aval (voir Figure supplémentaire S4), l'intensité de l'image des quatre groupes C1, C2 et C3 est relativement faible.Trente-six images avaient une taille de 0,57 ± 0,05 mm (moyenne ± SD).Ainsi, le grossissement de l'image était en moyenne de 11,4.L'espacement vertical entre les images est en moyenne de 1 mm (même espacement qu'un réseau de lentilles) et l'espacement horizontal est en moyenne de 1,6 mm (même espacement qu'un réseau de miroirs dichroïques).La taille de l'image étant bien inférieure à la distance entre les images, chaque image peut être mesurée indépendamment (avec une faible diaphonie).Pendant ce temps, les images de vingt-huit flux enregistrés par le spectromètre conventionnel à sept couleurs utilisé dans notre étude précédente sont présentées sur la figure 5B. Le réseau de sept miroirs dichroïques a été créé en supprimant les deux miroirs dichroïques les plus à droite du réseau de neuf miroirs dichroïques. miroirs de la figure 1a.Toutes les images ne sont pas nettes, la taille de l'image augmente de C1 à C7.Vingt-huit images mesurent 0,70 ± 0,19 mm.Il est donc difficile de maintenir une haute résolution sur toutes les images.Le coefficient de variation (CV) pour la taille d'image 28 sur la figure 5b était de 28 %, tandis que le CV pour la taille d'image 36 sur la figure 5a a diminué à 9 %.Les résultats ci-dessus montrent que le nouveau spectromètre à neuf couleurs augmente non seulement le nombre de couleurs mesurées simultanément de sept à neuf, mais qu'il offre également une résolution d'image élevée pour chaque couleur.
Comparaison de la qualité de l'image divisée formée par des spectromètres conventionnels et nouveaux.(a) Quatre groupes d'images séparées en neuf couleurs (C1-C9) générées par le nouveau spectromètre à neuf couleurs.(b) Quatre ensembles d'images séparées en sept couleurs (C1-C7) formées avec un spectromètre à sept couleurs conventionnel.Les flux (C0) de longueurs d'onde allant de 400 à 750 nm provenant de quatre points d'émission sont collimatés et incidents sur chaque spectromètre, respectivement.
Les caractéristiques spectrales du spectromètre à neuf couleurs ont été évaluées expérimentalement et les résultats de l'évaluation sont présentés dans la figure 6. Notez que la figure 6a montre les mêmes résultats que la figure 5a, c'est-à-dire à des longueurs d'onde de 4 C0 400 à 750 nm, les 36 images sont détectées. (4 groupes C1–C9).Au contraire, comme le montre les figures 6b à j, lorsque chaque C0 a une longueur d'onde spécifique de 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 ou 690 nm, il n'y a presque que quatre images correspondantes (quatre groupes détectés C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 ou C9).Cependant, certaines des images adjacentes aux quatre images correspondantes sont très faiblement détectées car les spectres de transmission C1 – C9 illustrés sur la figure 4b se chevauchent légèrement et chaque C0 possède une bande de 10 nm à une longueur d'onde spécifique, comme décrit dans la méthode.Ces résultats sont cohérents avec les spectres de transmission C1-C9 présentés sur les figures.4b et vidéos supplémentaires 2 et 3. En d'autres termes, le spectromètre à neuf couleurs fonctionne comme prévu sur la base des résultats présentés sur la fig.4b.Par conséquent, on conclut que la distribution d’intensité de l’image C1-C9 est le spectre de chaque C0.
Caractéristiques spectrales d'un spectromètre à neuf couleurs.Le nouveau spectromètre à neuf couleurs génère quatre ensembles d'images séparées de neuf couleurs (C1-C9) lorsque la lumière incidente (quatre C0) a une longueur d'onde de (a) 400-750 nm (comme le montre la figure 5a), (b) 530 nm.nm, (c) 550 nm, (d) 570 nm, (e) 590 nm, (f) 610 nm, (g) 630 nm, (h) 650 nm, (i) 670 nm, (j) 690 nm, respectivement.
Le spectromètre à neuf couleurs développé a été utilisé pour l'électrophorèse à quatre capillaires (pour plus de détails, voir Matériel supplémentaire) 31,34,35.La matrice à quatre capillaires se compose de quatre capillaires (diamètre extérieur 360 μm et diamètre intérieur 50 μm) situés à intervalles de 1 mm sur le site d'irradiation laser.Échantillons contenant des fragments d'ADN marqués avec 8 colorants, à savoir FL-6C (colorant 1), JOE-6C (colorant 2), dR6G (colorant 3), TMR-6C (colorant 4), CXR-6C (colorant 5), TOM- 6C (colorant 6), LIZ (colorant 7) et WEN (colorant 8) par ordre croissant de longueur d'onde fluorescente, séparés dans chacun des quatre capillaires (ci-après dénommés Cap1, Cap2, Cap3 et Cap4).La fluorescence induite par laser de Cap1-Cap4 a été collimatée avec un réseau de quatre lentilles et enregistrée simultanément avec un spectromètre à neuf couleurs.La dynamique d'intensité de la fluorescence à neuf couleurs (C1-C9) pendant l'électrophorèse, c'est-à-dire un électrophorégramme à neuf couleurs de chaque capillaire, est représentée sur la figure 7a.Un électrophorégramme équivalent à neuf couleurs est obtenu dans Cap1-Cap4.Comme l'indiquent les flèches Cap1 sur la figure 7a, les huit pics sur chaque électrophorégramme à neuf couleurs montrent respectivement une émission de fluorescence de Dye1-Dye8.
Quantification simultanée de huit colorants à l’aide d’un spectromètre d’électrophorèse à quatre capillaires à neuf couleurs.(a) Électrophorégramme à neuf couleurs (C1-C9) de chaque capillaire.Les huit pics indiqués par les flèches Cap1 montrent les émissions de fluorescence individuelles de huit colorants (Dye1-Dye8).Les couleurs des flèches correspondent aux couleurs (b) et (c).(b) Spectres de fluorescence de huit colorants (Dye1-Dye8) par capillaire.c Électrophérogrammes de huit colorants (Dye1-Dye8) par capillaire.Les pics des fragments d'ADN marqués au Dye7 sont indiqués par des flèches et leurs longueurs de bases Cap4 sont indiquées.
Les distributions d'intensité de C1 à C9 sur huit pics sont présentées sur les figures.7b, respectivement.Étant donné que C1-C9 et Dye1-Dye8 sont dans l'ordre des longueurs d'onde, les huit distributions de la figure 7b montrent les spectres de fluorescence de Dye1-Dye8 séquentiellement de gauche à droite.Dans cette étude, Dye1, Dye2, Dye3, Dye4, Dye5, Dye6, Dye7 et Dye8 apparaissent respectivement en magenta, violet, bleu, cyan, vert, jaune, orange et rouge.Notez que les couleurs des flèches sur la figure 7a correspondent aux couleurs des colorants sur la figure 7b.Les intensités de fluorescence C1-C9 pour chaque spectre de la figure 7b ont été normalisées de manière à ce que leur somme soit égale à un.Huit spectres de fluorescence équivalents ont été obtenus à partir de Cap1-Cap4.On peut clairement observer le chevauchement spectral de fluorescence entre le colorant 1 et le colorant 8.
Comme le montre la figure 7c, pour chaque capillaire, l'électrophorégramme à neuf couleurs de la figure 7a a été converti en un électrophérogramme à huit colorants par analyse multi-composants basée sur les huit spectres de fluorescence de la figure 7b (voir Matériel supplémentaire pour plus de détails).Étant donné que le chevauchement spectral de la fluorescence sur la figure 7a n'est pas affiché sur la figure 7c, Dye1-Dye8 peut être identifié et quantifié individuellement à chaque instant, même si différentes quantités de Dye1-Dye8 fluorescent en même temps.Cela ne peut pas être réalisé avec la détection traditionnelle à sept couleurs31, mais peut être réalisé avec la détection développée à neuf couleurs.Comme le montrent les flèches Cap1 sur la figure 7c, seuls les singulets d'émission fluorescente Dye3 (bleu), Dye8 (rouge), Dye5 (vert), Dye4 (cyan), Dye2 (violet), Dye1 (magenta) et Dye6 (jaune). ) sont observés dans l’ordre chronologique attendu.Pour l'émission fluorescente du colorant 7 (orange), en plus du pic unique indiqué par la flèche orange, plusieurs autres pics uniques ont été observés.Ce résultat est dû au fait que les échantillons contenaient des standards de taille, des fragments d’ADN marqués au Dye7 avec différentes longueurs de bases.Comme le montre la figure 7c, pour Cap4, ces longueurs de base sont de 20, 40, 60, 80, 100, 114, 120, 140, 160, 180, 200, 214 et 220 longueurs de base.
Les principales caractéristiques du spectromètre à neuf couleurs, développé à l'aide d'une matrice de miroirs dichroïques à deux couches, sont sa petite taille et sa conception simple.Étant donné que le réseau de miroirs décachromatiques à l'intérieur de l'adaptateur illustré à la fig.3c monté directement sur la carte du capteur d'image (voir Fig. S1 et S2), le spectromètre neuf couleurs a les mêmes dimensions que l'adaptateur, soit 54 × 58 × 8,5 mm.(épaisseur) .Cette taille ultra-petite est de deux à trois ordres de grandeur plus petite que celle des spectromètres conventionnels utilisant des réseaux ou des prismes.De plus, étant donné que le spectromètre à neuf couleurs est configuré de telle sorte que la lumière frappe perpendiculairement la surface du capteur d'image, l'espace peut être facilement alloué au spectromètre à neuf couleurs dans des systèmes tels que des microscopes, des cytomètres en flux ou des analyseurs.Analyseur d'électrophorèse à réseau capillaire pour une miniaturisation encore plus grande du système.Dans le même temps, la taille des dix miroirs dichroïques et filtres passe-bande utilisés dans le spectromètre à neuf couleurs n'est que de 10 × 1,9 × 0,5 mm ou 15 × 1,9 × 0,5 mm.Ainsi, plus de 100 petits miroirs dichroïques et filtres passe-bande, respectivement, peuvent être découpés respectivement à partir d'un miroir dichroïque et d'un filtre passe-bande de 60 mm2.Par conséquent, une série de miroirs décachromatiques peut être fabriquée à faible coût.
Une autre caractéristique du spectromètre à neuf couleurs réside dans ses excellentes caractéristiques spectrales.Il permet notamment l'acquisition d'images spectrales d'instantanés, c'est-à-dire l'acquisition simultanée d'images avec des informations spectrales.Pour chaque image, un spectre continu a été obtenu avec une gamme de longueurs d'onde de 520 à 700 nm et une résolution de 20 nm.En d'autres termes, neuf intensités de couleur de lumière sont détectées pour chaque image, soit neuf bandes de 20 nm divisant également la plage de longueurs d'onde de 520 à 700 nm.En modifiant les caractéristiques spectrales du miroir dichroïque et du filtre passe-bande, la plage de longueurs d'onde des neuf bandes et la largeur de chaque bande peuvent être ajustées.La détection de neuf couleurs peut être utilisée non seulement pour les mesures de fluorescence avec imagerie spectrale (comme décrit dans ce rapport), mais également pour de nombreuses autres applications courantes utilisant l'imagerie spectrale.Bien que l’imagerie hyperspectrale puisse détecter des centaines de couleurs, il a été constaté que même avec une réduction significative du nombre de couleurs détectables, plusieurs objets dans le champ de vision peuvent être identifiés avec une précision suffisante pour de nombreuses applications38,39,40.Étant donné que la résolution spatiale, la résolution spectrale et la résolution temporelle présentent un compromis en matière d'imagerie spectrale, la réduction du nombre de couleurs peut améliorer la résolution spatiale et la résolution temporelle.Il peut également utiliser des spectromètres simples comme celui développé dans cette étude et réduire encore davantage la quantité de calcul.
Dans cette étude, huit colorants ont été quantifiés simultanément par séparation spectrale de leurs spectres de fluorescence superposés sur la base de la détection de neuf couleurs.Jusqu’à neuf colorants peuvent être quantifiés simultanément, coexistant dans le temps et dans l’espace.Un avantage particulier du spectromètre à neuf couleurs réside dans son flux lumineux élevé et sa grande ouverture (1 × 7 mm).Le réseau de miroirs décanes a une transmission maximale de 92 % de la lumière provenant de l’ouverture dans chacune des neuf plages de longueurs d’onde.L'efficacité de l'utilisation de la lumière incidente dans la plage de longueurs d'onde de 520 à 700 nm est de près de 100 %.Dans une gamme de longueurs d’onde aussi large, aucun réseau de diffraction ne peut offrir une efficacité d’utilisation aussi élevée.Même si l’efficacité de diffraction d’un réseau de diffraction dépasse 90 % à une certaine longueur d’onde, à mesure que la différence entre cette longueur d’onde et une longueur d’onde particulière augmente, l’efficacité de diffraction à une autre longueur d’onde diminue41.La largeur d'ouverture perpendiculaire à la direction du plan sur la figure 2c peut être étendue de 7 mm à la largeur du capteur d'image, comme dans le cas du capteur d'image utilisé dans cette étude, en modifiant légèrement le réseau de décamètres.
Le spectromètre à neuf couleurs peut être utilisé non seulement pour l’électrophorèse capillaire, comme le montre cette étude, mais également à diverses autres fins.Par exemple, comme le montre la figure ci-dessous, un spectromètre à neuf couleurs peut être appliqué à un microscope à fluorescence.Le plan de l'échantillon est affiché sur le capteur d'image du spectromètre neuf couleurs via un objectif 10x.La distance optique entre l'objectif et le capteur d'image est de 200 mm, tandis que la distance optique entre la surface incidente du spectromètre à neuf couleurs et le capteur d'image n'est que de 12 mm.Par conséquent, l’image a été coupée à environ la taille de l’ouverture (1 × 7 mm) dans le plan d’incidence et divisée en neuf images couleur.Autrement dit, une image spectrale d'un instantané en neuf couleurs peut être prise sur une zone de 0,1 × 0,7 mm dans le plan échantillon.De plus, il est possible d'obtenir une image spectrale à neuf couleurs d'une zone plus grande sur le plan de l'échantillon en balayant l'échantillon par rapport à l'objectif dans la direction horizontale sur la figure 2c.
Les composants du réseau de miroirs décachromatiques, à savoir M1-M9 et BP, ont été fabriqués sur mesure par Asahi Spectra Co., Ltd. en utilisant des méthodes de précipitation standard.Des matériaux diélectriques multicouches ont été appliqués individuellement sur dix plaques de quartz de 60 × 60 mm et de 0,5 mm d'épaisseur, répondant aux exigences suivantes : M1 : IA = 45°, R ≥ 90 % à 520-590 nm, Tave ≥ 90 % à 610-590 nm. 610 nm.700 nm, M2 : IA = 45°, R ≥ 90 % à 520-530 nm, Tave ≥ 90 % à 550-600 nm, M3 : IA = 45°, R ≥ 90 % à 540-550 nm, Tave ≥ 90 % à 570-600 nm, M4 : IA = 45°, R ≥ 90 % à 560-570 nm, Tave ≥ 90 % à 590-600 nm, M5 : IA = 45°, R ≥ 98 % à 580-600 nm , R ≥ 98 % à 680-700 nm, M6 : IA = 45°, Tave ≥ 90 % à 600-610 nm, R ≥ 90 % à 630-700 nm, M7 : IA = 45°, R ≥ 90 % à 620-630 nm, Taw ≥ 90 % à 650-700 nm, M8 : IA = 45°, R ≥ 90 % à 640-650 nm, Taw ≥ 90 % à 670-700 nm, M9 : IA = 45°, R ≥ 90 % à 650-670 nm, Tave ≥ 90 % à 690-700 nm, PA : IA = 0°, T ≤ 0,01 % à 505 nm, Tave ≥ 95 % à 530-690 nm à 530 nm T ≥ 90 % à -690 nm et T ≤ 1 % à 725-750 nm, où IA, T, Tave et R sont l'angle d'incidence, la transmission, la transmission moyenne et la réflectance de la lumière non polarisée.
La lumière blanche (C0) avec une plage de longueurs d'onde de 400 à 750 nm émise par une source de lumière LED (AS 3000, AS ONE CORPORATION) a été collimatée et incidente verticalement sur le DP d'un réseau de miroirs dichroïques.Le spectre de lumière blanche des LED est présenté dans la Figure supplémentaire S3.Placez un réservoir acrylique (dimensions 150 × 150 × 30 mm) directement devant le réseau de miroirs décamera, en face du bloc d’alimentation.La fumée générée lorsque la neige carbonique était immergée dans l’eau a ensuite été versée dans un réservoir en acrylique pour observer les flux divisés C1-C9 de neuf couleurs émanant du réseau de miroirs décachromatiques.
Alternativement, la lumière blanche collimatée (C0) passe à travers un filtre avant d’entrer dans le DP.Les filtres étaient à l'origine des filtres à densité neutre avec une densité optique de 0,6.Utilisez ensuite un filtre motorisé (FW212C, FW212C, Thorlabs).Enfin, réactivez le filtre ND.Les bandes passantes des neuf filtres passe-bande correspondent respectivement à C9, C8, C7, C6, C5, C4, C3, C2 et C1.Une cellule de quartz de dimensions internes de 40 (longueur optique) x 42,5 (hauteur) x 10 mm (largeur) a été placée devant un réseau de miroirs décochromatiques, en face du BP.La fumée est ensuite introduite à travers un tube dans la cellule de quartz pour maintenir la concentration de fumée dans la cellule de quartz afin de visualiser les flux divisés C1-C9 de neuf couleurs émanant du réseau de miroirs décachromatiques.
Une vidéo du flux lumineux divisé en neuf couleurs émanant d’un ensemble de miroirs décaniques a été capturée en mode time-lapse sur l’iPhone XS.Capturez des images de la scène à 1 ips et compilez les images pour créer une vidéo à 30 ips (pour la vidéo optionnelle 1) ou 24 ips (pour les vidéos optionnelles 2 et 3).
Placer une plaque d’acier inoxydable de 50 µm d’épaisseur (avec quatre trous de 50 µm de diamètre à intervalles de 1 mm) sur la plaque de diffusion.La lumière d'une longueur d'onde de 400 à 750 nm est irradiée sur la plaque diffuseur, obtenue en faisant passer la lumière d'une lampe halogène à travers un filtre de transmission court avec une longueur d'onde de coupure de 700 nm.Le spectre lumineux est illustré à la Figure supplémentaire S4.Alternativement, la lumière traverse également l'un des filtres passe-bande de 10 nm centrés à 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 et 690 nm et atteint la plaque diffuseur.En conséquence, quatre points de rayonnement d’un diamètre de φ50 μm et de différentes longueurs d’onde ont été formés sur une plaque en acier inoxydable à l’opposé de la plaque diffuseur.
Un réseau de quatre capillaires avec quatre lentilles est monté sur un spectromètre à neuf couleurs, comme le montrent les figures 1 et 2. C1 et C2.Les quatre capillaires et les quatre lentilles étaient les mêmes que dans les études précédentes31,34.Un faisceau laser d'une longueur d'onde de 505 nm et d'une puissance de 15 mW est irradié simultanément et uniformément du côté des points d'émission de quatre capillaires.La fluorescence émise par chaque point d'émission est collimatée par la lentille correspondante et séparée en neuf flux de couleurs par un réseau de miroirs décachromatiques.Les 36 flux résultants ont ensuite été directement injectés dans un capteur d'image CMOS (C11440-52U, Hamamatsu Photonics KK.) et leurs images ont été enregistrées simultanément.
Kit de réaction prêt pour le séquençage du cycle d'amorce ABI PRISM® BigDye® (Applied Biosystems), 4 µl de colorant GeneScan™ 600 LIZ™ ont été mélangés pour chaque capillaire en mélangeant 1 µl d'étalon de matrice PowerPlex® 6C (Promega Corporation), 1 µl d'étalon de taille de mélange.v2.0 (Thermo Fisher Scientific) et 14 µl d’eau.Le standard matriciel PowerPlex® 6C se compose de six fragments d'ADN marqués avec six colorants : FL-6C, JOE-6C, TMR-6C, CXR-6C, TOM-6C et WEN, par ordre de longueur d'onde maximale.Les longueurs de bases de ces fragments d'ADN ne sont pas divulguées, mais la séquence de longueurs de bases des fragments d'ADN marqués avec WEN, CXR-6C, TMR-6C, JOE-6C, FL-6C et TOM-6C est connue.Le mélange contenu dans le kit de réaction prêt pour le séquençage du cycle d'amorce ABI PRISM® BigDye® contient un fragment d'ADN marqué avec le colorant dR6G.Les longueurs des bases des fragments d'ADN ne sont pas non plus divulguées.GeneScan™ 600 LIZ™ Dye Size Standard v2.0 comprend 36 fragments d’ADN marqués par LIZ.Les longueurs de bases de ces fragments d'ADN sont 20, 40, 60, 80, 100, 114, 120, 140, 160, 180, 200, 214, 220, 240, 250, 260, 280, 300, 314, 320, 340, Bases 360, 380, 400, 414, 420, 440, 460, 480, 500, 514, 520, 540, 560, 580 et 600.Les échantillons ont été dénaturés à 94°C pendant 3 minutes, puis refroidis sur glace pendant 5 minutes.Des échantillons ont été injectés dans chaque capillaire à 26 V/cm pendant 9 s et séparés dans chaque capillaire rempli d'une solution de polymère POP-7™ (Thermo Fisher Scientific) avec une longueur effective de 36 cm et une tension de 181 V/cm et un angle de 60°.DEPUIS.
Toutes les données obtenues ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses informations complémentaires.D'autres données pertinentes pour cette étude sont disponibles auprès des auteurs respectifs sur demande raisonnable.
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